Validação de métodos laboratoriais aplicadas a análises com marcadores microssatélites1
Tiago Silva Oliveira et. al
“A troca de informação sobre biodiversidade e a utilização de recursos genéticos podem ser melhor realizadas se os laboratórios que geram as informações puderem demonstrar que seus resultados são confiáveis através de metodologias adequadas de validação.”
“A validação de metodologias desenvolvidas em laboratórios é efetuada após seleção, desenvolvimento e otimização dos métodos (SWARTZ; KRULL, 1997), sendo destacada pelas normas internacionais, nacionais e sistema de qualidade, como um procedimento importante para a obtenção de resultados confiáveis ao uso pretendido.”
“Com o objetivo de definir critérios que sirvam para demonstrar a confiabilidade de resultados em laboratórios onde se trabalha com marcadores de DNA, foram realizados pequenos experimentos que permitam uma diagnose dos erros associados às metodologias utilizadas para gerar marcadores microssatélites. O erro relacionado à quantificação de DNA por comparação com quantidades padrão, em gel de agarose, foi relacionado à robustez da reação em cadeia da polimerase. Estimaram-se também os erros associados às estimativas do tamanho de DNA em eletroforese em poliacrilamida.”
“Para extração de DNA de folhas, foram coletadas amostras de 50 a 100 mg de folhas jovens de algodoeiros, e procedeu-se basicamente da mesma maneira que Menezes et al. (2008). O tecido foliar foi colocado em microtubos de capacidade de 1,5mL e submergidas em nitrogênio líquido. A maceração foi feita com pistilos adaptados aos microtubos, na presença de nitrogênio líquido.”
“A adequação de modelos de regressão utilizados para o cálculo do número de pares de bases de moléculas de DNA foi feita em eletroforese de géis de poliacrilamida. Mediram-se as bandas fornecidas por um marcador de peso molecular de 50; 100; 150; 200; 250; 300 e 350, em milímetros, em 3 diferentes cubas, com 6 repetições para cada cuba. Os valores foram utilizados para cálculo do número de pares de base de acordo com dois diferentes métodos: i) um modelo de regressão em que o tamanho do DNA, em número de pares de base, é igual ao inverso da mobilidade, em milímetros (SURZYCKI, 2000). ii) Um modelo de regressão de melhor ajuste escolhido pelo programa Table Curve 2D (STACON, 2010).”
“A porcentagem de acerto caiu com o aumento da quantidade de DNA, sendo 40; 57 e 20%, respectivamente, para 150; 200 e 250 ng de DNA. Assim, para diminuir os erros associados à quantificação de DNA pode-se sugerir a repetição da quantificação do DNA quando este for quantificado como maior que 100 ng.”
“As estimativas do número de pares de bases de cada banda do marcador de peso molecular após a análise de regressão de melhor ajuste, para cada caso, fornecida pelo programa TableCurve 2, estão apresentadas na Tabela 4.”
“A precisão da quantificação de DNA varia com a quantidade de DNA mensurada.”
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